在系统性红斑狼疮（SLE）患者中，B细胞参与了自身免疫反应，但基础平淡的B细胞导向疗法在减弱对疫苗的体液免疫反应和指令免疫扼制的同期，仅炫夸出戒指的疗效。拓荒针对致病性克隆的更灵验的调理方法是现在尚未得志的需求。在这里，咱们展示了活动性SLE患者B细胞DNA挫伤反应（DDR）的ATR/Chk1路线的增强激活。用I型IFN（SLE免疫的迂回驱动因子）调理B细胞，通过干扰素颐养因子1与其基因运行子的结合指令ATR的抒发。通过特异性扼制剂（VE-822）对B细胞中的ATR进行药理学靶向，减弱了其免疫原性，包括促炎性细胞因子分泌、血浆白卵白造成和抗体生成。要而言之，这些发现细目ATR介导的DDR轴是SLE中I型IFN介导的B细胞反应的互助器，而况是一个潜在的新的调理靶点。

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DNA挫伤反应（DDR）机制是免疫系统发育和功能的动态特征。DDR的迂回作用包括监测淋巴细胞造成抗原受体、产生抗体、纯熟和快速分裂以搪塞感染所需的基因组重排(1，2).由遗传或表不雅遗传因素引起的执续性DDR是恶性疾病和发育轮廓征的驱动特征。值得注意的是，极度DDR最近在一系列自身免疫性疾病中被报说念，包括系统性红斑狼疮（SLE）、多发性硬化症（MS）、类风湿性枢纽炎（RA）和艾卡迪-古蒂埃轮廓征(1，三–6).关联词，DDR路线的分子复杂性，以及对环境和细胞依赖性DDR参与的意志不及，遏止了DDR在这些疾病中的调理靶向性。

DDR信号转导的主要路线是三种卵白激酶ATM（共济失调毛细血管膨胀症突变）、ATR（ATR和Rad3相关）和DNA-PKcs（DNA依赖性卵白激酶催化亚单元）(7).ATM和DNA-PKcs被以为是双链DNA断裂信号级联的顶峰，而ATR主要在单链DNA断裂时被激活，并对紫外线等引起DNA复制压力的因子作念出反应(8，9).一朝激活，这些DDR组分不错单独或协同磷酸化包括检验点激酶2（Chk2；Thr）在内的好多卵白质68，通过ATM），Chk1（作事345，通过ATR），H2AX（序列号139γΗ2ΑΧ）和p53（序列号15)，决定细胞反应和红运(8).值得注意的是，p95/NBS1（也称为nibrin）经常在受损的基因组位点与γΗ2ΑΧ共定位，而况不错传播ATR和ATM依赖的信号(10，11).诚然ATM、ATR和DNA-PKcs有一些共同的功能，可是它们的作用以及与它们的扰动相关的表型不同(7，9).与ATM和DNA-PKcs不同，ATR在增殖细胞中是必不可少的；因此，ATR基因敲除会导致细胞增殖失败和早期胚胎致死(12，13).

SLE是一种异质性和潜在的严重的自身免疫性疾病，环境和遗传因素之间的互相作用导致复杂的生物汇注混乱，最终导致免疫失调(14).B细胞极度与SLE的病理生理学水平密切相关，有助于免疫颐养的销毁(15–18).更具体地说，SLE的B细胞主要致病特征包括：（i）抗原递呈才智增强的多动性；（ii）细胞质层、悼念、双负悼念和移行细胞的数目加多；（iii）促炎和抗炎细胞因子分泌极度，凸起表现为白细胞介素-10（IL-10）、IL-6、IL-4和肿瘤坏死因子-β（TNF-β）加多和IL-2生成减少；以及（iv）加多致病性自身抗体的分泌(15，18，19).SLE患者的这种极度B细胞功能受到与IFN分子特征相关的I型干扰素（IFN）的影响，尤其是在中重度狼疮患者中(20，21).尽管B细胞在SLE发病机制中起着紧迫作用，但其调控机制现在还仅仅部分了解；现在针对B细胞的调理方法[如利妥昔单抗和belimumab(22)]排斥悉数这个词B细胞群，导致免疫扼制和减弱对疫苗的体液免疫反应(23).

在上述基础上，现在尚未得到得志的需求是了解致病性B细胞克隆中的分子事件，这将允许其遴荐性靶向，使健康的B细胞序列不受影响，从而介导免疫保护。诚然B细胞容易出现DDR乌有，因为DDR是在抗体各样化中被遴荐的(8)越来越多的左证标明SLE患者白细胞DDR恶果低下，B细胞DDR与自身免疫性疾病病理生理的分子接洽尚不明晰(三–5，24–26).类风湿枢纽炎患者B细胞ATM下调介导促造口造瘘B细胞表型导致腐臭性疾病(6).为此，发扬致病性B细胞DDR的分子路线可能有助于SLE患者合理的调理有蓄意的假想。

在这里，咱们使用卵白质组学和转录组学分析从SLE患者和健康东说念主B细胞评释了显性DDR在SLE B细胞。通过对主要DDR路线的实验筛选发现，与健康B细胞比拟，SLE B细胞中ATR/Chk1轴有着深刻的激活。健康B细胞（SLE样环境）的IFN-α深远模拟SLE B细胞的DDR特征，而体外扼制ATR活性则逆转了细胞的致病表型。咱们还提供了左证，IFN颐养因子1（IRF1）是SLEⅠ型IFN信号的紧迫孝敬者，是介导IFN-α处置的B细胞ATR通路激活的DDR机制的一部分。咱们的数据标明，IFN-α介导的、IRF1驱动的ATR机制通过促进B细胞过度活跃而参与SLE的发病机制，并评释了I型IFN促进体液免疫反应的一种先前未被证实的路线。

为了细目与SLE中B细胞致病作用相关的功能紧迫性的未知机制，咱们领先评估了从活动性SLE（SLEDAI）患者外周血等分离的总B细胞的卵白质组学特征≥8） 年齿/性别匹配的健康对照组（HC）(图1A以及表S1的东说念主口统计数据）。生成的数据集包含6449个主卵白组，这些主卵白组根据至少两个肽的存在而进一步过滤，从而得到4995个卵白质的卵白质列表。总卵白的主因素分析炫夸两组之间有很强的分离(图1B).首创性富集分析（IPA）和团结路分析揭示了与SLE发病机制相关的迂回已知特征，如补体激活、轮回抗体颐养、细胞因子（IL-1、IL-4、IL-6和IL-10）、抗原呈递、炎症反应等，核因子κB（NF-κΒ）激活与雷帕霉素（mTOR）信号转导的哺乳动物靶点(图1C，图S1和表S2）。值得注意的是，SLE患者的B细胞对DNA挫伤刺激表现出丰富的反应。尤其是DNA拓荒，p53信号转导，G1-与HC比拟，SLE B细胞的卵白质组学特征中S检验点颐养和其他DDR相关路线的比例过高(图1C以及图S1）。为了考证富集的DDR，咱们对γH2AX进行了流式细胞术检测，γH2AX是DDR激活的经典标的(27).咱们检测到东说念主类和小鼠（NZB/W-F1）SLE外周血B细胞的γH2AX水平均高于HC，进一步证实了SLE B细胞中DDR的加剧(图1D以及图S2）。接下来，咱们筹商SLE中富集DDR是B细胞的一种特殊特征照旧免疫细胞群的广宽特征。因此，γH2AX的抒发水平也被评估在外周提拔性T细胞（CD4）中的抒发水平+)，T细胞毒性（CD8+)T颐养性（CD4+CD25+Foxp3型+)，经典单核细胞（HLA-DR+CD14型+CD16?)，中间单核细胞（HLA-DR+CD14型+CD16+)，非经典单核细胞（HLA-DR+CD14型?CD16+)和中性粒细胞（CD66b+)SLE和HC患者。通过流式细胞术和共聚焦显微镜检测，在检测到的多种SLE源性免疫细胞中，B细胞表现出与HC比拟最显赫的γΗ2ΑΧ抒发的加多（图S3和S4）。

图1卵白质组学和转录组学分析细目DDR是SLE B细胞的一个特征。

(A)用磁珠法分离SLE和HC患者外周血B细胞(n=11个东说念主/组）进行卵白质组学分析。(B)主因素分析（PCA）使用SLE和HC患者的悉数卵白质的抒发手艺。(C)应用1094个SLE和HC相反抒发的卵白质[乌有发现率（FDR）<0.05]进行IPA。所示为精选的典型旅途（FDR<0.2）。DDR相关旅途以粗体炫夸。(D)CD19门控外周血单个核细胞的流式细胞术分析+检测SLE和HC患者B细胞DDR活性(n=7个东说念主/组）。代表性的频率图和直方图炫夸未染色细胞（灰色）、染色的SLE（红色）和HC（蓝色）细胞的叠加。未配对学生的t测试*P<0.05(E)流式细胞仪分析在SLE和HC患者磁珠分离的B细胞中跨细胞周期抒发γΗ2ΑΧ的接洽(n=每组6东说念主）。细胞周期分析承袭Ki67和7-AAD。比较两组（SLE和HC）的疏通阶段。两组间任何细胞期均无统计学兴趣兴趣[双向方差分析（ANOVA）]。(F)基因集富集分析（GSEA）分析SLE患者B细胞亚群（静息期、过渡期3期、同型更始悼念、双阴性2型和抗体分泌型）DDR的变化(n=9）与HC比拟(n=12）使用已发布的RNA测序（RNA seq）数据集(15).液相色谱法；串联质谱法；ES，充实分数；归一化富集分数；FDR<0.25截止。MFI，平均荧光强度。赶走以平均值±SEM走漏。

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由于DDR包括细胞周期检验点禁止，咱们试图接洽SLE B细胞中γΗ2ΑΧ抒发的升高是否与细胞周期的特定阶段相关。因此，咱们通过流式细胞仪对崭新分离的SLE和HC患者B细胞中Ki67增殖特异性象征物、7-AAD细胞DNA含量象征物和γΗ2ΑΧ进行细胞周期分析。尽管γΗ2ΑΧ在SLE中显然过抒发，但在职何细胞阶段均未发现统计学上的显赫相反，这标明与SLE相关的γΗ2ΑΧ的上调可能与细胞周期无关(图1E以及图S5，A和B）。

终末，为了接洽统统销毁颐养的DDR的卵白质组学数据是否可之外推到转录组中，如若DDR特征中存在特定的B细胞亚群，咱们对SLE和HC患者的B细胞亚群进行了基因集富集分析（GSEA），应用一个公开可用的RNA测序（RNA-seq）数据集(15).赶走标明，真的悉数主要的SLE B细胞亚群都参与了DDR的调动，包括静息期、过渡期3、同型更始悼念、双阴性2和抗体分泌型B细胞(图1F).总之，这些数据标明，B细胞在SLE患者中表现出一种深刻的DDR。

接下来，咱们试图通过检测主激酶卵白和DDR的构成部分，即ATR、ATM、DNA-PKcs、Chk1、Chk2、p53和p95/NBS1来飘舞DDR的具体分子机制(7)，在SLE和hcb细胞中(图2A).由于DDR信号的激活和传导经常需要卵白质磷酸化，因此大广宽靶点都所以磷酸化的模式进行接洽的(28).咱们发现pATR（Thr）水平升高1989)，pChk1（序列号345)，p-p53（序列号15)与HC-B细胞比拟，SLE的p95/NBS1与pATM无相反（Ser1981)，pChk2（推力68)和pDNA PKcs（序列号2056)通过免疫荧显豁微镜或流式细胞仪检测(图2B).SLE B细胞中ATR通路的激活也通过单独个体的Western陈迹分析得到证实（图S6）。这些数据标明ATR/Chk1通路主要在SLE B细胞中被激活，而ATM/Chk2和DNA-PKcs则不起迂回作用。此外，为了进一步评释ATR介导的DDR路线对SLE是特异性的，而不是继发于任何自身免疫性疾病的炎症环境，咱们检测了强直性脊柱炎（AS）患者临近分离的B细胞中的pATR卵白水平（东说念主口统计学表S1）。AS是一种自身炎症性疾病，与SLE不同，B细胞在发病机制中不起主要作用，而况衰败Ⅰ型IFN信号(29).与HC比拟，AS养殖B细胞的pATR卵白水平无显赫变化（图S7）。

图2.ATR/Chk1-DDR通路在SLE B细胞中被激活。

(A)主要DDR路线的走漏图为ATR/Chk1、ATM/Chk2和DNA-PKC。(B)DDR孝敬者和免疫荧光共聚焦显微镜图像或染色SLE和HC B细胞的代表性直方图的接洽[CD19+，通过荧光激活细胞分选（FACS）或磁珠分离]。pATR（Thr）的代表性共焦图像1989;绿色；n=每组5东说念主），pChk1（Ser345;绿色；n=每组5东说念主），p95/NBS1（红色；n=每组5东说念主），pATM（Ser1981;n=7东说念主/组），pDNA-PKcs（Ser2056;绿色；n=5东说念主/组），pChk2（Thr68;绿色；n=6东说念主/组），和p-p53（Ser15;绿色；n=每组5东说念主）。对pATR、pChk1、pDNA-PKcs、pChk2和p-p53的分析赶走走漏为每个个体的平均黑点/细胞，pATM走漏每个个体的MFI，p95/NBS1走漏每个个体的平均强度/细胞。对于pATM，代表性直方图炫夸未染色细胞（灰色）、染色SLE（红色）和染色HC细胞（蓝色）的叠加。比例尺，2μm。(C)扩散评估（Ki67）和(D)流式细胞术检测SLE和HC磁珠分离的B细胞凋一火（PARP1和caspase-3断裂）(n=每组7个东说念主）和/或共焦显微镜检验。代表性直方图炫夸未染色细胞（灰色）、染色SLE细胞（红色）和染色HC细胞（蓝色）叠加。裂解caspase-3染色，阳性信号用绿色走漏，细胞用4′，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）核染色（蓝色；n=每组3东说念主）。比例尺，2μm。悉数病例的赶走均以平均数±扫描电镜走漏，未配对学生的统计显赫性t测试，P≥0.05[不显赫（ns）]*P<0.05，以及**P<0.01。

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DDR机制可指令细胞凋一火和/或增殖，尤其是ATR/Chk1的激活可影响细胞增殖(30，31).关联词，与HC比拟，SLE B细胞的增殖（Ki67）和凋一火[切割的聚（ADP核糖）团员酶1（PARP1）和切割的caspase-3]都莫得不同，这标明ATR/Chk1通路的减轻可能对SLE的这些经由莫得显赫的影响，其他细胞的反应也可能受到影响(图2，C和D).SLE和hcb细胞增殖率无显然相反(图2C)G值显赫裁汰1相养殖的B细胞（图S5B），以及卵白质组学和转录组学数据标明G1-S和G2-M个检验点(图1C图S1）辅导咱们进一步接洽增殖期（S期）和有丝分裂期（G2-M期）B细胞。为此，咱们检测了pATR在S（EdU）中的抒发水平+)还有G2-米（pH3+)相养殖细胞，体外激活后（IL-21/CpGb/sCD40L鸡尾酒用于生涯和轻度指令增殖）(32–38)SLE和HC患者外周血总B细胞EdU深远（图S8A）。赶走标明，在SLE和HC中，EdU的ATR通路均上调+与EdU比拟?B细胞，而pH3+与pH3比拟，细胞表现出pATR抒发加多?细胞只存在于狼疮环境中。尽管如斯，pATR在EdU中的抒发+SLE B细胞显然高于EdU+HC-B细胞，pH3无显然变化+SLE B细胞与pH3比拟?SLE B细胞。这些数据标明，尽管最终总体增殖率莫得调动，但ATR在SLE中B细胞的助长和分裂中可能比HC更为活跃（图S8、B和C）。

为了发扬ATR介导的DDR机制在SLE样环境中对B细胞的功能参与，咱们从健康东说念主的周围分离出总B细胞，并在体外激活后深远于主要的I型IFN-α(图3A).ATR mRNA、pATR和pChk1卵白水平在IFN-α给药后上调，而ATM mRNA、pATM、pChk2和pDNA-PKcs的抒发无显然变化(图3，B至D).此外，IFN-α处置的B细胞在S和G中表现出ATR通路的激活2-细胞周期的M期与SLE B细胞相通（图S8，A到C）。因此，B细胞的IFN-α深远再现了SLE中ATR介导的DDR路线上调的主要特征，这是一个充分的实验安装，不错模拟SLE的环境。

图3心房调动干扰素-α调理的B细胞中细胞因子的开释。

用磁珠法从健康东说念主外周血等分离出B细胞，用IL-21/CpGb/sCD40L生涯和轻度增殖刺激搀和液培养（对照）IFN-α（850U/ml），体外模拟狼疮环境，用ATRi（5μΜ）或二甲基亚砜（DMSO）培养，取决于实验。(A)干扰素-α处置的B细胞体外实验走漏图。(B)用及时定量逆转录团员酶链反应（RT-PCR）测定对照组和IFN-α处置条款下ATR和ATM mRNA的相对抒发水平；n=每种情况3东说念主；配对学生的t测试）。(C)对对照组和干扰素-α处置的B细胞进行染色和定量（每个个体的平均黑点/细胞）的pATR（Thr1989;红色），pChk2（推力68;绿色），pDNA PKcs（Ser2056;绿色）并用DAPI核染色（蓝色；n=每种情况3东说念主；配对学生的t测试）。比例尺，2μm。(D)pChk1（Ser）评估345)和pATM（Ser1981)在对照组和干扰素-α处置的B细胞中，通过流式细胞术，随后将MFI标准化为对照细胞的MFI（未配对学生的t测试）。细胞在CD19上被门控+. (E)ATRi（berzosertib）在IFN-α处置的B细胞体外评估细胞因子生成的实验走漏图。培养2天后网罗细胞培养上清液。(F)流式细胞仪检测培养D2开释的细胞因子（IL-10、IL-6、IL-4、TNF-β和IL-2）(n=每种情况10东说念主；配对学生的t测试）。赶走用平均值±SEM走漏。P≥0.05（纳秒）*P<0.05**P<0.01，经典成人故事以及****P<0.0001。

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为了发扬ATR在SLE发病机制中的作用，咱们领先接洽了IFN-α处置的B细胞在ATR扼制后产生的细胞因子，推敲到B细胞是多种细胞因子的丰富开端，这些细胞因子在SLE中平淡受到干扰。到现在为止，ATR介导的DDR路线是否参与细胞因子的产生和分泌，现在尚不明晰。为此，berzosertib（ATRi），一种通过阻断Chk1激活来扼制ATR功能的药物扼制剂(39)，加入IFN-α处置的健康B细胞(图3E以及图S9）。然后，咱们评估了IFN-α调理的B细胞中紧迫细胞因子[TNF-α，IL-13，IL-4，IL-10，IL-6，IL-2，TNF-β，IFN-γ，IL-17A，IL-12p70，一种包括配体（APRIL）、B细胞激活因子（BAFF）和CD40配体（CD40L）]在有或莫得心房的B细胞助长中的开释。心房内IL-10、IL-6、IL-4和TNF-β水平显赫裁汰(图3F)IL-2、IL-12p70、CD40L、BAFF、APRIL、IFN-γ水平升高(图3F，图S10）。要而言之，这些数据标明ATRi可能会从头编程SLE样B细胞的细胞因子谱。

迄今为止的接洽赶走标明，ATR介导的DDR通路在SLE的B细胞产生细胞因子中起着迂回作用，可能所以自分泌的神态驱动SLE的病理生理学。此外，无人不晓，SLE B细胞通过激活景象和增强抗原提呈才智，随后加多血浆白卵白的造成和抗体的产生(15，18，40–42).为此，咱们评估了IFN-α处置的B细胞ATR活性扼制经由中不同时代点的细胞活化（CD40、CD80和名义BAFF）和抗原呈递才智[东说念主类白细胞抗原-DR（HLA-DR）](图4，A至C，以及图S11、A和B）。在ATR被扼制后，IFN-α处置的B细胞中HLA-DR的激活和抗原提呈被下调，即使在低剂量下给以ATR时亦然如斯（图S12）。值得注意的是，这种表型可能是ATR依赖的和Chk1不依赖的，因为ATR-Chk1与CHR-124（Chk1活性的灵验扼制剂Chk1i）互相颐养的卑鄙药物扼制并不影响这些细胞特色（图S12C和S13）。因此，ATR激活自己在IFN-α处置的B细胞的激活中起着迂回作用，而上述ATR扼制时的可变细胞因子抒发并不反馈过度活跃的B细胞群。

图4ATRi扼制IFN-α处置的B细胞的激活和抗体的造成。

用磁珠法从健康东说念主的外周血等分离出B细胞，并用IL-21/CpGb/sCD40L存活和轻度增殖搀和培养液在IFN-α（850 U/ml）和ATRi或DMSO（对照）存在或不存在的情况下培养2（D2）、3（D3）和7（D7）天，具体取决于实验。(A)IFN-α处置的B细胞体外ATRi实验用于评估细胞激活景象的走漏图（ATRi，5μΜ）。流式细胞术定量检测CD19门控数据+的(B)CD40(n=每种情况5个东说念主），CD80(n=每种情况5个东说念主），BAFF(n=每种情况5东说念主），以及(C)HLA-DR(n=每种情况4个东说念主）。配对学生的t悉数病例均承袭该历练。(D)ATRi实验（ATRi，2μΜ）走漏图，在体外用IFN-α处置的B细胞评估名义和开释的免疫球卵白。(E)代表性流式细胞术门控名义IgM，IgD和IgG在D7和D3和D7定量(n=每种情况5到7个东说念主；双向方差分析）。(F)应用LEGENDplex手艺通过流式细胞术检测细胞培养上清液中开释的免疫球卵白（IgM、IgD、IgA、IgE、IgG1、IgG2、IgG3和IgG4）(n=每种情况8东说念主；配对学生的t测试）。赶走用平均值±SEM走漏。P≥0.05（纳秒）*P<0.05***P<0.001，以及****P<0.0001。

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接下来，咱们接洽抗体（即免疫球卵白）的产生是否会受到影响，因为它们的产生可能会跟着细胞因子的开释而受到影响，如CD40L、BAFF和APRIL，但另一方面，也可能由于促炎性细胞因子（如IL-6和TNF-β）的减少而减弱。赶走标明：培养第3天，名义免疫球卵白M（sIgM）显然裁汰；在第7天，sIgD裁汰，而IFN-α处置的B细胞深远于ATRi组与未深远组比拟莫得任何显赫相反(图4，D和E).此外，IFN-α处置的心房肌细胞开释的IgM、IgA、IgE、IgG1、IgG2、IgG3和IgG4显赫裁汰(图4、D和F)辅导ATR-DDR通路在抗体造成中起着紧迫作用。终末，由于IFN-α处置的B细胞名义IgM和IgD水平裁汰，并开释免疫球卵白，咱们瞻望同种类型更始和抗体分泌的B细胞会减少。因此，咱们试图接洽B细胞亚群的造成(图5A).在培养的第7天，IFN-α-处置的具有ATRi的B细胞的同型更始悼念（SWME）细胞（CD19）水平显赫裁汰+免疫球卵白?川地27+)，总存储单元（CD19+川地27+)，移行细胞（CD19+免疫球卵白灰暗的CD38+)，和等离子体层（CD19+免疫球卵白?川地27+CD38+)，而同型无开关存储器（UNSWME）（CD19+免疫球卵白+川地27+)，灵活（CD19+免疫球卵白+川地27?)双阴性细胞（CD19+免疫球卵白?川地27?)与未接受心房震荡调理的患者比拟，真的莫得受到影响(图5，A和B).

图5心房阻断IFN-α处置的B细胞造成浆卵白。

从健康东说念主外周血等分离出B细胞(n=5～7），承袭磁珠法，与IL-21/CpGb/sCD40L齐集培养，在IFN-α（850 U/ml）和ATRi或DMSO（对照）存在或不存在的情况下培养3（D3）和7（D7）天。(A)IFN-α处置的B细胞体外ATRi实验（ATRi，2μΜ）走漏图，用于评估B细胞亚群分化景象。(B)流式细胞术在D7的代表性门控细胞群和D3和D7的相应群体的量化（D3，n=每种情况5东说念主；第7天，n=每种情况7个东说念主）。流式细胞仪检测B细胞的免疫表型如下：无开关悼念（UNSWME）为CD19+免疫球卵白+川地27+，灵活如CD19+免疫球卵白+川地27?，交换存储器（SWME）为CD19+免疫球卵白?川地27+，双阴性（DN）为CD19+免疫球卵白?川地27?，总内存为CD19+川地27+过渡为CD19+免疫球卵白灰暗的CD38+，等离子体层为CD19+免疫球卵白?川地27+CD38+。赶走用平均值±SEM走漏。P≥0.05（纳秒）**P<0.01，以及***P<0.001（双向方差分析）。

终末，咱们接洽了ATRi是否通过影响细胞周期来影响SLE B细胞的反应。咱们在IFN-α处置的B细胞中的数据炫夸，在ATRi上，G显赫加多0-与二甲基亚砜（DMSO）条款（对照）比拟，养殖B细胞的不雅察赶走与在耸峙显微镜下不雅察到的细胞簇造成减少一致（图S14）。因此，通过将SLE样B细胞引入静息景象（G0)，其免疫应答如预期下跌。

总的来说，这些赶走标明，扼制ATR活性裁汰了IFN-α处置的B细胞的免疫原性：（i）减少IL-10、IL-6、IL-4和TNF-β的开释，同期加多IL-12p70和IL-2的开释；（ii）减弱细胞活化；（iii）扼制免疫球卵白的造成；（iv）扼制类交换和等离子体层的造成；（五）在休息景象下逮捕他们。

为了探讨IFN-α径直调控SLE样B细胞ATR的分子机制，咱们对IRF1结合位点进行了染色质免疫千里淀（ChIP）实验自动条码读取器调控区域，如在硅分析中预测的【真核运行子数据库（EPD）数据库】(图6A).SLE患者B细胞ATR和IRF1 mRNA水平均升高(图6B)以及在健康的B细胞中使用IFN-α(图3B和6摄氏度).在IFN-α处置的B细胞中与抗IRF1抗体或对照IgG发生芯片反应后，咱们发现了一个IRF1结合事件（即。，位置1)绽放自动条码读取器基因运行子贴近自动条码读取器专为抗IRF1反应富集的基因(图6D).这些数据标明IRF1可能径直与自动条码读取器调控序列转录介导其抒发。

图6.IRF1径直与自动条码读取器IFN-α处置的B细胞中的基因并颐养ATR活性。

(A)的走漏图自动条码读取器转录肇端位点周围的基因位点（TSS，箭头；编码区，黑盒）。走漏图上方的数字走漏与TSS和IRF1（EPD数据库）预测结合位点的距离。(B)SLE和HC患者磁珠分离的B细胞IRF1和ATR mRNA水平(n=6/组），通过定量及时RT-PCR（未配对学生的t测试）。(C)及时定量RT-PCR检测IRF1 mRNA水平(n=每种情况下4个东说念主）在干扰素-α调理的B细胞（配对学生的t测试）。细胞用IL-21/CpGb/sCD40L存活和轻度增殖搀和液及IFN-α（850u/ml）培养2天。(D)IRF1-to结合位点的芯片分析自动条码读取器基因位点。芯片实验使用从干扰素-α处置的B细胞分离的染色质中的抗IRF1抗体（a-IRF1）或对照抗体（IgG）进行(n=4名健康个体；未配对学生的t测试）。(E)用siIRF1或siNeg（对照）扼制IFN-α处置的B细胞中IRF1抒发的走漏图。(F)及时定量RT-PCR检测siNeg和siIRF1条款下IRF1、ATR和ATM mRNA的相对抒发水平(n=每种情况3东说念主）。(G)对SiNeg和siIRF1 B细胞进行pATR（Thr）染色和定量（puncta/cell）1989;绿色）或pChk1（Ser345;红色）并标有DAPI（蓝色；n=每种情况3东说念主；未配对学生的t测试）。比例尺，2μm。(H)流式细胞术分析过渡期（CD19+免疫球卵白灰暗的CD38+)和plasmablast（CD19+免疫球卵白?川地27+CD38+)siNeg和siIRF1上的B细胞(n=每种情况3东说念主；配对学生的t测试）。对于悉数情况，P≥0.05（纳秒）*P<0.05**P<0.01，以及****P<0.0001。对于（B）至（D）和（F），赶走用平均值±SEM走漏。

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径直评估IRF1是否与自动条码读取器基因位点具有颐养作用，咱们用小干扰IRF1 RNA（siIRF1）或阴性对照（siNeg）对IFN-α处置的B细胞进行IRF1基因敲除，并检测ATR mRNA、ATR、pATR（Thr）1989)和pChk1（Ser345)卵白质水平(图6，E至G，以及图S15）。同期检验ATM的mRNA水平看成对照，以确保IRF1对ATR的特异性(图6F).在这些细胞中，IRF1的敲除下调ATR mRNA、ATR、pATR和pChk1卵白水平，而保留ATM mRNA水平(图6，F和G，以及图S15）。IRF1千里默扼制了过渡型和浆型B细胞亚群的发育，与药物ATR扼制后的赶走相通(图6H以及图S16）。总的来说，这些赶走复古IRF1介导ATR活性，解释了IFN-α调理和SLE B细胞中不雅察到的DDR。

尽管DDR与炎症景象的各个方面相关，但对其减轻颐养怎样使特定免疫细胞群致病性知之甚少。自身免疫性疾病中DDR驱动的分子机制尚不明晰。B细胞在系统性红斑狼疮（SLE）的发病经由中起着迂回作用，但其致病性的驱动因素尚不明晰。在这项接洽中，通过对SLE患者B细胞的卵白质组学和转录组学分析，咱们揭示了一种销毁颐养的DDR。更具体地说，咱们形容了一种与B细胞功能贫窭相关的先前未被证实的机制，这意味着ATR介导的路线参与SLE B细胞的特异性富集。咱们的体外数据炫夸，在I型干扰素驱动的自身免疫反应经由中，ATR/Chk1路线被触发，ATR活性的靶向药物扼制扼制了SLE病理生理学的迂回特征，包括B细胞活化、血浆白卵白造成、抗体生成和促炎性细胞因子开释。终末，咱们提供左证评释这种ATR过度激活是通过与IRF1的径直分子互相作用介导的，这些数据将SLE的I型IFN特征信号与ATR/Chk1通路的上调以及IRF1介导的致病性B细胞的指令接洽在一王人。ATR的药理学靶向性减轻了ATR通路看成SLE潜在调理靶点的致病细胞特征。

与文献一致，在SLE-T细胞毒性和中性粒细胞中也不雅察到DDR的上调(43，44)而B细胞的DDR加多最为显赫。咱们的数据来自于低级阶段和活动期患者，这标明这些发现可能反馈了SLE的主要致病机制。尽管DDR因素在SLE相关经由中的致病细胞中的作用也曾被提倡，包括它们在V（D）J重组、体细胞过度突变和细胞物化中的作用(三，5，26)，对它们在自身反应性B细胞反应中的具体孝敬的全面阐明还不明晰。在这里，咱们通过飘舞ATR介导的DDR通路销毁B细胞的颐养，并将此通路与它们的致病潜能接洽起来，来扩展这方面的常识。Taher的一项接洽炫夸，SLE B细胞ATR/Chk1通路激活显然加多，而ATM/Chk2和DNA-PKcs莫得调动等等。(45)报说念了SLE患者的B细胞ATR激活减少和ATM激活加多。与这项接洽相悖，咱们的实验假想是由既有高疾病活动性又莫得接受细胞毒性药物调理的患者构成，以幸免不雅察到的DDR可能受到这些药物的影响。与咱们的接洽赶走一致，在eb病毒（EBV）感染的配景下，对B细胞淋巴瘤的接洽标明ATR/Chk1参与了极度B细胞反应(46–50).卓越是，在最近一项检测EBV深远的B细胞DDR激活的接洽中，ATR/Chk1，而不是ATM/Chk2通路被激活，而特异性靶向ATR大约扼制感染后B细胞的极度功能(50).SLE患者患B细胞淋巴瘤的风险加多，EBV病毒被以为是狼疮自身免疫的潜在诱因，标明这些疾病有共同的致病机制(51).在这些情况下，ATR/Chk1的销毁调控可能导致极度的B细胞轮廓。另一方面，ATM/Chk2通路是B细胞自身免疫的接洽热门，因为最近有报说念称，在一组患有严重疾病的RA患者中，它不错驱动B细胞的致病性(6).在DDR扰动和感染后，ATM销毁督察既依赖又触发IFN信号(52，53).这些数据和咱们的接洽赶走标明，不同的DDR路线可能根据自身免疫环境的类型驱动吞并细胞群的不同致病反应。咱们的接洽为ATR介导的自身免疫路线，卓越是在颐养SLE的B细胞反应方面，加多了一个新的头绪。

靶向B细胞或B细胞抒发分子在SLE患者中产生了有但愿的赶走(54).最近被认同的SLE调理方法包括抗BAFF的单克隆抗体和通过阻断I型IFN（IFN-α和IFN-β）作用的受体单克隆抗体靶向I型IFN(55).这些和其他调理SLE的标准疗法（如抗CD20药物和环磷酰胺）会浪费大广宽B细胞，包括那些参与抗病毒免疫的B细胞，这在现时2019年大流行的冠状病毒疾病眼前产生了要紧罢休(56).SLE患者对更灵验、更安全的调理现在还莫得得到得志，这标明疾病的发病机制和现存的调理方法之间存在着缺失的接洽。咱们设念念，这种接洽可能是B细胞的极度DDR，不受现时药物的影响。在SLE B细胞中靶向ATR介导的DDR通路不错阻断B细胞的致病性反应，同期可能幸免保护性反应。

咱们的数据标明，在IFN-α处置的B细胞中，ATR活性被阻断后，B细胞的特征并拒接易导致SLE，举例抗体生成的减少；等离子体层；可溶性IL-10、IL-6、IL-4、TNF-β和可溶性IL-2水平升高，但BAFF开释量加多，膜结合BAFF下跌。现在用于系统性红斑狼疮（SLE）的抗BAFF调理既针对可溶性BAFF，也针对膜结合型BAFF，对可溶性BAFF具有更高的效价(57，58).诚然这两种模式的BAFF都具有生物学活性，但膜结合和可溶性BAFF的特异靶向性是否会产生不同的临床赶走还莫得细目。这些发现凸起了ATR看成SLE的潜在调理靶点，揭示了ATR-DDR通路在B细胞产生细胞因子中的紧迫作用。现在尚不明晰这是否是ATR活性和细胞因子生成信号之间的径直影响，照旧由于B细胞分化景象的调动。罗迪耶等等。(59)评释ATM活性对成纤维细胞产生IL-6至关紧迫；关联词，当ATR被扼制时，IL-6的产生减少。此外，在最近的一项接洽中(6)白细胞介素6分泌加多与类风湿枢纽炎患者B细胞激活ATM的残障相关。因此，咱们得出论断，在SLE B细胞中，细胞因子的开释可能受到极度ATR介导的DDR的影响，而况颐养细胞因子分泌的特定DDR信号根据细胞类型和免疫微环境而变化。

尽管咱们的接洽赶走标明，与HC比拟，SLE B细胞中ATR和Chk1都过度磷酸化，但唯有当ATR被扼制时，才会影响SLE样B细胞的活化和抗原呈递景象，而Chk1则莫得受到扼制。瞻望ATR或Chk1的下调会引起肖似的调动，因为Chk1的激活需要ATR的磷酸化。关联词，有可能这两种因素并不老是看成一种线性路线阐述作用，正如几项接洽所复古的那样，标明心房震荡和Chk1i的作用存在相反(60–63).在这个方朝上，有左证标明ATR驱动类开关重组，而Chk1更参与正常B细胞的助长(64–66)标明它们在B细胞生理学上有着显赫的孝敬。斯佩罗尼等等。(67)赶走标明，Chk1，而不是ATR，驱动U2OS细胞紫外线照耀后的复制进度。Chk1通过其与增殖细胞核抗原的特异性互相作用介导的ATR稀薄的作用也在前边被形容过(68，69)，而卢西亚尼等等。(62)诠释了一个ATR依赖的，Chk1稀薄的，S期内的检验点，它扼制复制的运行。此外，在一项草创性的接洽中(63)作家揭示了ATR与复制卵白A（RPA）互相作用的作用，复制卵白A是细胞深远于遗传毒性应激后指令DDR的迂回传感器(70)，与Chk1介导的复制应激反应无关。终末，接洽了ATR和Chk1之间不同时代点依赖性激活的可能性；关联词，这并莫得得到证实，这标明这两个构成部分具有不同的作用(60).咱们的赶走揭示了I型IFN通过IRF1在B细胞中指令ATR介导的DDR而参与SLE发病的新机制。为复古这少量，接洽赶走（i）对无IFN标志的AS病患者的B细胞炫夸ATR激流水公说念常，以及（ii）IFN-α调理的B细胞ATR激流水平加多，标明i型IFN对于增强ATR活性是必要的。IRF1被以为是常见B细胞淋巴瘤的潜在驱动因素之一，并与多发性骨髓瘤癌基因1卵白（MUM1）互相作用，后者在B细胞淋巴瘤的进展中起作用(71–74).根据EPD数据库，除了IRF1之外的其他分子也可能径直与ATR颐养区域互相作用，这标明进一步的接洽可能揭示在B细胞介导的疾病中，驱动自身反应性B细胞的ATR通路的其他机制。

在咱们的接洽中，IFN-α处置的B细胞在ATR或IRF1扼制时不成充分分化为浆卵白，这标明IRF1-ATR轴对血浆白卵白的造成至关紧迫。在系统性红斑狼疮中，血浆白卵白的数目经常显赫加多，并与疾病活动和耀斑相关(18).血浆白卵白/血浆细胞的耗竭现在用于系统性红斑狼疮的调理打扰(54).关联词最近有报说念称，在脂多糖刺激后，IRF1参与了B细胞向浆细胞分化(75)，ATR在B细胞系中的特殊作用尚未被形容。要而言之，这些发现标明IRF1-ATR轴对B细胞分化非常紧迫，并在SLE极度血浆卵白造成中起作用。

总之，咱们诠释了SLE患者的B细胞中一种特定的DDR路线过度激活，SLE是SLE中反应最过度的细胞群之一。咱们发现ATR介导的DDR信号通过IRF1在B细胞中极度颐养，从而驱动致病细胞的反应。诚然这与阐明SLE的发病机制和B细胞介导的自身免疫性疾病相关，但这也可能为ATR信号在自身免疫中的特殊颐养作用偏执与IFN信号的互助提供了新的视力。总的来说，咱们的接洽赶走标明，靶向附近SLE样B细胞的IRF1-ATR轴可能对SLE有调理作用。为了这个方针，麦克纳利等等。(1)在噬血细胞性淋巴组织细胞增多症和多发性硬化症的东说念主类自身免疫性疾病中，提倡使用化学DDR扼制剂来扼制抗原激活的T细胞的免疫反应。在这个方朝上，各式遴荐性ATR扼制剂已在调理实体瘤的1/2期临床历练中进行了历练(39，76).VE-822的市集称号为berzosertib，已炫夸出可接受的安全性和早期疗效，现在正在18个正在进行的临床历练中进行评估（举例NCT04266912、NCT03641313和NCT04052555）。

将ATR介导的DDR路线靶向致病性B细胞可能会改善自身免疫反应，但同期也会损害对病原体的免疫反应，尽管这至少不错部分地通过使用经批准的疫苗接种来克服。此外，咱们发现的调理实施可能会因为衰败针对自身反应性B细胞的ATR路线而不是平淡的B细胞定向扼制的有蓄意而受到遏止。此外，用患者自身产生的B细胞建立一个合适的体外实验管说念，保留其疾病特征，从而不错接洽心房效应，这是异日接洽的一个紧迫问题。

采集SLE患者外周血[n=51，按1997年好意思国风湿病学会标准分类(77)]以及健康的东说念主(n=103）。在取样时，悉数患者都有中度到高度的疾病活动（SLEDAI≥而且，绝大广宽东说念主在捐献前12个月莫得接受过细胞毒性药物。悉数患者和健康东说念主都是通过第四内科学系风湿病和临床免疫科、“阿提康”大学病院和“阿斯克利皮耶恩”轮廓病院（均在希腊雅典）招募的。在采集样本前，获取悉数个东说念主的知情痛快（希腊雅典，有蓄意10/22-6-2017）。悉数患者在抽血前至少24小时扞拒用任何调理剂量。为了拆除炎症环境的非特异性影响，咱们使用了AS患者的外周血样本(n=4）看成附加对照，因为它们炫夸平淡的炎症反应，但莫得致病性B细胞反应和自身抗体的产生。表S1记忆了临床和东说念主口学特征。

小鼠的悉数程序均安妥机构指南，并由希腊联邦兽医局（1044/1319；希腊雅典）审查和批准。新西兰黑♀×新西兰白葡萄酒♂F1小鼠（即NZB/W-F1）自觉发展出肖似东说念主类SLE的自身免疫轮廓征(78).NZB（NZB/OlaHsd）和NZW（NZW/OlaHsd）小鼠从Envigo购买。NZB/W-F1表现为患病≥100纳克/分升的尿卵白（诞生6个月后），在10周龄时就已预安妥。每个实验重复三次。悉数的动物都被保存在生物医学接洽基金会雅典动物接洽所。实验中使用的NZB/W-F1小鼠均为雌性。每笼6只老鼠被关在温度（21°到23°C）和湿度禁止的菌落室，保执12小时光照/12小时晦暗周期（07:00至19:00亮），标准食品（4RF21，意大利穆塞多拉Srl）和水轻率提供。根据欧洲实验动物科学协会齐集会的规则，动物设施内的悉数老鼠都经过健康监测经营的依期检验，莫得病原体。

同期从冷冻[保存在90%胎牛血清（FBS）/10%二甲基亚砜中]等分离B细胞（以幸免批量效应）?SLE和HC患者的外周血单个核细胞（PBMCs）(n=11/种情况），使用EasySep东说念主类B细胞分离试剂盒（目次号17954，STEMCELL Technologies），对PBMC进行脱氧核糖核酸酶处置。使用由4%十二烷基硫酸钠、100 mM tris/HCl和100 mM二硫苏糖醇（pH 7.6）构成的缓冲液对纯化的细胞群进行统统细胞裂解，并在95°C下培养5分钟。在水浴中进一步超声处置裂解样品30分钟。在17000下离心20分钟，从碎屑中纯化卵白质索求物g.将上清液转化到干净的试管中，并按照Hughes的单罐固相强化样品制备（SP3）方法进行处置等等。(79)，不酸化，包括在100 mM碘代乙酰胺中的卵白质烷基化程序。使用0.25-μg胰卵白酶/内卵白酶Lys-C（来自Lysobacter enzymogenes（LysC）搀和物）的0.25-μg胰卵白酶/内卵白酶Lys-C在25 mM碳酸氢铵缓冲液中进行消化以在1400 rpm下承接回荡。第二天，移除磁珠，通过SP3肽净化进一步纯化肽样品，并在真空离神思中蒸干。将干燥后的样品熔解在缓冲液A中，超声处置5min，用纳米滴手艺测量280nm处的吸光度，测定肽浓度。

每个样品分析三次（手艺复制）。使用C18捕集柱（aclaim PepMap100；100μm×2 cm；Thermo Fisher Scientific）以10μl/min的流量预浓缩约0.5μg肽，然后将其装载到50 cm长的C18柱上（内径75μm；粒径2μm；100峎；Acclaim PepMap100 RSLC，Thermo Fisher Scientific）。高效液相色谱法（RSLCnano，Thermo Fisher Scientific）的二元泵由溶液A【2%（v/v）乙腈（ACN）溶于0.1%（v/v）甲酸中】和溶液B【80%（v/v）ACN于0.1%（v/v）甲酸中】构成。用线性梯度分离肽，从5%B到27.5%B在58分钟内徐徐到40%B在2分钟内达到99%B并在那处停留5分钟，然后允许均衡20分钟，流速为300毫升/分钟。将柱置于50°C的烘箱中。

洗脱的肽由纳米喷雾源电离，并由Q-Exactive HF-X质谱仪（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA）以数据依赖模式进行检测。肽的质地/电荷比为350～1500(米/z)MS1的分辨率为120000，自动增益禁止（AGC）为3×106，最猛进样时候为100ms，其次是12串联质谱最丰富的2+-四+带电离子，分辨率为15000，AGC为1×105，最大注入时候为22ms，阻遏窗口为1.2米/z在28标准化碰撞能量（NCE）和30 s动态拆除条款下，使用软件Xcalibur（Thermo Fisher Scientific）禁止系统并获取原始文献，并使用米/z445.12003年。

使用卵白质组发现器2.4对原始文献进行搜索智东说念主2019年9月19日从UniProt下载的参考卵白质组FASTA数据库（包含9595959个卵白质序列）和使用多肽搜索选项激活并承接使用mspeSearch和SequestHT节点的卵白质计量器用_HCD28_PD光谱库。卵白质的动态修饰为氧化，+15.995da（M）；脱酰胺，+0.984da（N，Q）；N端乙酰化修饰，+42.011da；碰到蚀本，?131.040 dam（M）；和Met loss+acetyl?89.030达米。卡巴咪甲基/+57.021da（C）为静态改性剂。对赶走进行筛选，筛选出高自信肽，并添加增强肽和卵白质详确。唯有主卵白被评估。定量丰采基于强度值，并标准化为总肽量。使用卵白质组发现软件（基于配景的配对）对健康个体和SLE患者的卵白质标准化丰采进行统计评估t测试）。复制功能的最小百分比树立为60%。共飘舞出4995个卵白质含有至少两种肽。质谱卵白质组学数据已通过PRIDE存入卵白质交换协会(80)数据集记号符为PXD031389的伙伴存储库。

基于FDR（乌有发现率）<0.05的1094个相反抒发卵白质和至少两个抒发的肽被用作STRING富集分析的输入(81)和QIAGEN IPA（恰根公司。；https://digitalinsights.qiagen.com/IPA) (82)器用。FDR<0.05用于细目字符串分析中丰富的基因本色生物学经由和京都基因和基因组百科全书（KEGG）术语的显赫性，FDR<0.2用于细目IPA非定向分析中富集典型旅途的显赫性。相反抒发卵白质和富集术语的完好列表见表S2。

以fastq模式发布的数据(15)下载并处置，如下所述。用FastQC软件评价测序质地(83).fastq模式的原始读取被剪辑为适配器内容和低质地的基(问<30），在3'端使用Cutapt(84)并使用star2.6算法与东说念主类基因组（hg38版块）一致(85).用HTSeq进行基因定量(86).GENCODE详确文献版块29用于详确。在R(87).

GSEA公司(88)在分子特征数据库v.7.0的基础上，对咱们的基因集进行了富集特征分析?日记10更始P值乘以折叠变化。显赫上调的基因排在首位，而显赫下调的基因则排在终末。然后使用默许树立履行GSEA事前名次的分析。当FDR时，富集被以为是显赫的(问值）<25%。

采集健康东说念主和SLE或AS患者的肝素化血（10ml），用Histopaque-1077（Sigma-Aldrich）密度梯度法分离PBMCs。浅易地说，血液用磷酸盐缓冲盐水（PBS）稀释1:1，并在Histopaque-1077溶液（Sigma-Aldrich）上分层。试管在500℃离心g室温下不刹车30分钟。网罗PBMC层，用PBS冲洗细胞。如若除了PBMCs外还需要中性粒细胞，细胞分离承袭Histopaque-1077/Histopaque-1119（Sigma-Aldrich）双梯度法。浅易地说，血液用PBS稀释1:2，分层于Histopaque-1077/Histopaque-1119（1:1）。试管在1200时离心g室温下不刹车30分钟。在Histopaque-1119和Histopaque-1077层的界面收围聚性粒细胞，并用PBS冲洗。对于总B细胞的分离，EasySep东说念主类B细胞分离试剂盒（目次号17954，STEMCELL Technologies）也在撤职Histopaque-1077条约的大广宽实验中使用。

为了分析和分离免疫细胞，再行鲜东说念主PBMCs或中性粒细胞分离的单细胞悬浮液用抗CD19、CD4、CD8、CD25、HLA-DR、CD14、CD16和CD66b进行染色。悉数分类细胞均为7-AAD阴性（420404，BioLegend）。细胞内染色包括Foxp3，γΗ2ΑΧ（Ser139)，Κi67，pATM（序列号1981)和cPARP1（Asp214)，根据制造商的说明，使用Foxp3染色安装（目次号：00-5523-00，eBioscience）对细胞进行固定和染色。细胞在FACSAria III（BD Biosciences）上使用BD FACSDiva v8.0.1软件（BD Biosciences）进行分类。为了分析EasySep东说念主B细胞分离后培养的细胞，用抗CD19、CD40、CD80、BAFF、HLA-DR、IgD、CD27、CD38、IgM和IgG的结合抗体对细胞进行染色。在给药DDR药物扼制剂后进行凋一火检测，根据制造商的建议，用抗CD19、annexin V（目次号640908，BioLegend）和7-AAD对培养的B细胞进行进一步染色。为分析小鼠外周血B细胞，承袭Histopaque-1077密度梯度法分离PBMCs。然后用抗B220/CD45R和γΗ2ΑΧ（Ser）的结合抗体对PBMCs进行染色139).数据采集在FACSAria III（BD Biosciences）、BD Facselesta和BD FACSDiva v8.0.1软件（BD Biosciences）上进行。用FlowJo软件进行分析。表S3包括抗体的详备信息（荧光色素、克隆、供应商、目次号和浓度）。

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